吸出原培養(yǎng)液；

加入2mL左右PBS，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶潤(rùn)洗細(xì)胞，吸出PBS丟棄；

加入1mL左右胰酶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使之浸潤(rùn)所有細(xì)胞；

放入培養(yǎng)箱消化，消化3-5分鐘（根據(jù)具體細(xì)胞稍作延長(zhǎng)或縮短），顯微鏡下看到細(xì)胞開始漂浮，可以加入2mLPBS，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞懸浮，不要吹打剩下的貼壁細(xì)胞；

吸出培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的PBS和細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，在離心管中加入3mL含血清的培養(yǎng)基終止消化并吹散細(xì)胞，使細(xì)胞盡量呈單顆細(xì)胞的懸浮液；

原培養(yǎng)瓶中加入0.5mL胰酶，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶浸潤(rùn)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)消化，直到細(xì)胞塊中間全部收縮變圓，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶可脫落；

用3mL含血清的培養(yǎng)基終止消化，將瓶底的細(xì)胞全部吹下，并輕輕吹吸分散細(xì)胞呈單顆；

收集細(xì)胞懸液與第一次消化下來的細(xì)胞合并到一個(gè)離心管；

離心收集細(xì)胞沉淀，1200rpm/min 3分鐘，離心完吸出上清丟棄；

加入新鮮培養(yǎng)基，吹打幾下混勻細(xì)胞，按需接種到新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)基，擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進(jìn)行培養(yǎng)；

檢查培養(yǎng)箱二氧化碳，溫度和水盤。